Тучные клетки как мишень антивоспалительного действия активированного протеина C

Тучные клетки как мишень антивоспалительного действия активированного протеина C

Функции активированного протеина C (АРС), как модулятора воспаления, реализуются через рецептор, активируемый протеазой 1 (PAR1) на клетках эндотелия, моноцитах и других клетках. Некоторые из этих эффектов могут быть вызваны регуляцией АРС активности тучных клеток. Чтобы характеризовать влияние АРС на дегрануляцию перитонеальных тучных клеток крысы (ПТК) в ответ на агонисты, такие как тромбин и вещество 48/80, было исследовано действие АРС на секрецию гистамина. АРС (0,1-1 нМ) снижал осво- бождение гистамина из ПТК, активированных спонтанно, веществом 48/80 или тромбином (50-100 нМ). Вызванное АРС протективное действие на активированные ПТК опосредовано через PAR1, как доказано с помощью блокады PAR1 антагонистами (Mpr(Cha) (0,1 мкМ), SCH 79797 (0,2 мкМ)). Показано, что профи- лактическое внутрибрюшинное введение АРС (0,1 нМ) стабилизирует ПТК у крыс с иммобилизационным стрессом, блокируя освобождение медиаторов воспаления (гистамина и β-гексозаминидазы). Выявлено противовоспалительное и ранозаживляющее действие АРС на модели экспериментальной язвы желудка у крыс. АРС ускоряет заживление язвы желудка у крыс, сдвигая фазу пролиферации на более ранние сроки. Таким образом, показано, что АРС стабилизирует тучные клетки крыс in vitro и in vivo и также проявляет антиульцерогенное действие. (Цитокины и воспаление. 2009. Т. 8, № 3. С. 48–53.)

Ключевые слова: воспаление, тучные клетки, репарация тканей, активированный протеин C, рецептор, активируемый протеиназой.

Активированный протеин C (АРС) — антикоагулянтная сериновая протеиназа, которая образуется из протеина С (РС) при действии тромбина и блокирует его образование по механизму отрицательной обратной регуляции, инактивируя факторы Va и VIIIa свертывания крови [5]. Тромбин, взаимодействуя с рецептором эндотелия — тромбомодулином, превращает профермент PC, связанный с эндотелиальным рецептором РС (EPCR), в протеиназу АРС [3, 5]. Кроме антикоагулянтной активности у АРС обнаружены противовоспалительные свойства в условиях in vitro (на клетках эндотелия, лейкоцитах, кератиноцитах и др.) и in vivo (сепсис, пневмония и др.) [13, 14]. Эти защитные свойства АРС обусловлены его способностью ингибировать экспрессию провоспалительных цитокинов, адгезивных молекул, предотвращать адгезию лейкоцитов и снижать гибель пациентов с тяжелым сепсисом [5, 7, 14]. АРС, ингибируя образование TNFα и адгезию лейкоцитов, супрессирует воспалительный ответ клеток эндотелия микрососудов кишечника in vitro, а также in vivo в модели эрозии желудка у крыс [8] и при экспериментальных колитах [11]. Действие АРС на клетки реализуется благодаря взаимодействию с рецепторами эндотелия EPCR и PAR1 [10]. Ранее нами показано, что пептидагонист PAR1 (PAR1-АР) ускоряет заживление экспериментальной язвы желудка у крыс и кожных ран (у мышей и крыс) [2, 3]. Однако нет данных о влиянии АРС на перитонеальные тучные клетки (ПТК) крыс при стрессорном воздействии и репарации тканей при ацетатной язве желудка. Ранее было показано, что PAR1-АР способен освобождать медиатор воспаления гистамин из ПТК [4]. Вопрос о влиянии АРС на секрецию гистамина ПТК остается открытым, хотя есть данные о регуляции ферментом освобождения β-гексозаминидазы из ПТК, активированных спонтанно или веществом 48/80 [1].

Целью настоящей работы было исследование влияния АРС на освобождение гистамина ПТК в норме и при иммобилизационном стрессе, а также действия АРС на процесс репарации ткани в модели ацетатной язвы желудка у крыс.

Материалы и методы

В работе использованы самцы беспородных крыс весом 200–350 г. Эксперименты на животных выполняли в соответствии с этическими принципами и нормативными документами, рекомендованными Европейским научным фондом (ESF) и Хельсинской декларацией о гуманном отношении к животным. В работе использовали: АРС (Chromogenix и Sigma); плюроник F-127 (Sigma), тромбин (Human, Bovine) (Sigma), антагонисты PAR1-рецептора тромбина — Mpr(Cha) (Mercaptopropionyl-F(Cha-Cha)RKPNDK-NH2) и SCH 79797 (N3-cyclopropyl-7-[[4-(1-methylethyl)phenyl]methyl]-7H-pyrrolo[3, 2-f]quinazoline-1,3-diamine). Определяли амидазную активность APC и тромбина по отношению к хромогенным субстратам S2366 (pyroGlu-Pro-Arg-pNA) и S2238 (H-D-Phe-Pip-Arg-pNA) (Chromogenix) и антикоагулянтную активность АРС по удлинению частичного тромбопластинового времени (АЧТВ) свертывания плазмы крови человека.

Метод определения секреции гистамина ПТК крыс. Выделяли тучные клетки из перитонеальной полости крыс (n = 200) и исследовали их секреторную активность по освобождению гистамина. ПТК инкубировали с определенными концентрациями АРС, антагонистов PAR1 (Mpr(Cha), SCH 79797) (10 мин при 37 °С), и добавляли либо активатор — вещество 48/80 (200 мкг/мл), либо буфер (HEPES-NaCl, содержащий 10 мM NaCl, 5 мM KCl, 1 мM CaCl2, 1 мM MgCl2, 5 мM глюкозы, рН 7,4), либо тромбин в высоких концентрациях (10–100 нМ). Содержание гистамина определяли флуориметрически с ортофталевым альдегидом (Sigma) на Fluoroskan Ascent (США) [12] и вычисляли % секреции гистамина по формуле А/(А + В) × 100 %, где А — содержание медиатора в надосадочной жидкости, В — в осадке.

Модель иммобилизационного стресса. Крысам (n = 48) внутрибрюшинно вводили АРС (Chromogenix) (0,02 мкг/кг; 0,1 нМ АРС) и через 30 мин у животных вызывали стресс иммобилизацией в течение 1 часа. Далее выделяли ПТК и исследовали их секреторную активность по освобождению гистамина (см. выше) и β-гексозаминидазы (по расщеплению субстрата р-нитрофенил-N-ацетил-β-D-глюкозаминида (Sigma)).

Модель ацетатной язвы желудка. Готовили композицию, содержащую 0,2 нM АРС (0,004 мкг АРС/300 мкл геля) в геле неионного поверхностно-активного вещества (ПАВ) плюроника F-127, в концентрации 30 % (по весу). Эксперименты по заживлению язвы проводили на крысах массой 200-250 г (n = 24), используя метод Okabe et al. [9]. Животным под эфирным наркозом апплицировали ледяную уксусную кислоту на серозную оболочку желудка. Через 2 часа после операции опытным животным (n = 12) в желудок через зонд вводили композицию, содержащую АРС. Контрольным животным вводили плюроник в физиологическом растворе (n = 12). Критериями оценки заживления язвы были относительная площадь язвы и параметры морфометрического анализа образцов грануляционной ткани желудка в области язвы, взятых на 3 и 7 сутки опыта. Гистологические срезы ткани желудка окрашивали гематоксилином и эозином. Интенсивность репаративного процесса в подслизистом слое желудка оценивали по процентному содержанию макрофагов, нейтрофилов и эозинофилов (маркеров воспаления) и фибробластов (маркера пролиферации).

Статистическую обработку данных проводили в парных выборках, используя t-критерий Стьюдента.

Результаты и обсуждение

В первой серии экспериментов in vitro исследовали влияние АРС и тромбина на секреторную активность ПТК в норме и при их активации. Установлено, что АРС в широком диапазоне низких концентраций (0,01-7,5 нМ) не оказывал влияния на секрецию гистамина тучными клетками с низкой спонтанной активностью (СП) ( < 20 %), а в концентрациях 0,1 и 1 нМ снижал секрецию гистамина (на 6 и 14 %, соответственно, р < 0,05) ПТК с высокой СП ( > 20%) (данные не представлены). Исследование влияния АРС на ПТК, активированные, веществом 48/80 показало, что АРС в низких концентрациях (0,1, 0,5 и 1 нМ) достоверно снижал секрецию гистамина на 11,8, 9,6 и 19,1 %, соответственно, индуцированную дегранулятором 48/80 (65,2 ± 0,8 %) (рис. 1). Эти результаты коррелируют с ранее полученными данными о том, что АРС в низких концентрациях ( < 5 нМ) подавляет секрецию β-гексозаминидазы активированными ПТК [1].

 

Ранее было показано, что тромбин в концентрациях > 10 нМ повышает секрецию β-гексозаминидазы ПТК [4]. Мы показали, что в низких концентрациях (0.001-1 нМ) тромбин не влиял на секрецию гистамина ПТК в норме. В высоких концентрациях (10-300 нМ) тромбин достоверно повышал секрецию гистамина в 1,6, 2,1, 2,9 и 3,5 раза по сравнению со спонтанной секрецией (12,7 ± 1,5 %) (рис. 2а). Более того, АРС в концентрациях (0,1, 0,5 и 1 нМ) защищал тучные клетки от действия высоких концентраций тромбина (50-100 нМ), уменьшая освобождение гистамина ПТК (рис. 2б). Снижение секреции гистамина ПТК может быть обусловлено освобождением клетками под действием АРС оксида азота (NO), который блокирует секрецию медиаторов воспаления [1].

 

Мы предположили, что действие АРС на тучные клетки, также как и на клетки эндотелия, моноциты и др., реализуется через PAR1, подобно действию тромбина. Данное предположение было подтверж- дено с помощью антагонистов PAR1 (PAR1-Ан) — Mpr(Cha) (0,1 мкМ) и SCH 79797 (0,2 мкМ), которые в используемых концентрациях не влияли на секрецию гистамина ПТК, но блокировали действие высо- ких концентраций тромбина (рис. 3 а, в). Установлено, что блокада PAR1 отменяет протекторное действие АРС (рис. 3 б, г). По-видимому, тучные клетки — новая мишень противовоспалительного действия АРС, помимо ранее выявленного протекторного действия на клетки эндотелия и моноциты и др.[14].

Во второй серии экспериментов исследовали in vivo влияние АРС (профилактическое однократное внутрибрюшинное введение) на секреторную активность ПТК крыс, подвергавшихся иммобилизационному стрессу. Известно, что ментальный и окислительный стрессы вызывают повышение проницаемости тонкого кишечника и другие воспалительные ответы [15], в которых вероятно участвуют медиаторы воспаления, освобождаемые клетками иммунной системы, в том числе тучными клетками. Мы предположили, что иммобилизационный стресс также может стимулировать активацию ПТК и освобождение медиаторов воспаления, а АРС — регулировать их секрецию. Контролем служили две группы животных: 1) интактные животные, не подвергавшиеся стрессу и 2) стрессированые животные, не получавшие АРС. Показано, что уровень секреции гистамина и β-гексозаминидазы ПТК в опытной группе, получавшей 0,1 нМ АРС, составил 11,7 ± 0,4 и 14 ± 0,7 %, соответственно, а в контрольных группах — 1) 18,1 ± 1,5 и 14,5 ± 0,9 %, 2) 28,3 ± 1,4 и 21,6 ± 1,2 %, соответственно. Таким образом, профилактическое однократное введение АРС приводило к достоверному снижению секреции медиаторов (гистамина — на 16,6 %; β-гексозаминидазы — на 7,6 %), вызванной стрессом (рис. 4а, б). На фоне действия вещества 48/80 на ПТК, полученные от опытных животных (АРС), наблюдали достоверное снижение уровня секреции гистамина и β-гексозаминидазы (на 14 % и 27 %, соответственно) по сравнению с ПТК, полученными от обеих контрольных групп животных (рис. 4а, б).

Как видно из представленных результатов, APC в низких концентрациях, в условиях in vitro и in vivo стабилизирует тучные клетки, проявляя противовоспалительные свойства. Учитывая, что воспалитель- ная реакция организма — первая фаза заживления раны при повреждении тканей, мы предположили, что APC способен ускорять заживление язвы желудка. В третьей серии экспериментов исследовали влияние АРС на процесс заживления экспериментальной ацетатной язвы желудка у крыс. Анализ размеров язв желудка показал, что на 3 сутки эксперимента в опытной группе животных площадь язв составляла 8,4 ± 2,6 мм2, а на 7 сутки — 2,7 ± 0,7 мм2, что было в 7 раз меньше, чем в контрольной группе животных. Микроскопическое исследование гистологических срезов подслизистого слоя желудка в очаге язвообразования выявило ряд отличий между контрольной и опытной (АРС) группами животных на 3 сутки эксперимента. У животных контрольной группы среди клеточных элементов преобладали нейтрофилы и макрофаги (35,0 ± 0,7 и 32,4 ± 0,6 %, соответственно). При введении АРС опытной группе животных уже на 3 сутки заживления воспалительная реакция и отек были менее выражены по сравнению с контрольными животными. АРС вызывал увеличение количества клеток с типичными признаками фибробластической дифференцировки (28,9 ± 1,4 % по сравнению с 16,5 ± 0,7 % в контроле) (рис. 4а). Это может свидетельствовать об ускоренном созревании фибробластических предшественников, мигрирующих в раневую зону. Под действием АРС содержание маркеров воспаления снижалось до 71,1 ± 1,6 % (в контроле — 84,3 ± 2,7 %). Анализ ангиогенеза в подслизистом слое желудка выявил, что в опытной группе животных количество зрелых сосудов было в 2,1 раза больше, чем в контрольной группе животных (рис. 4б). Таким образом, у животных, получавших APC, отмечено ускорение ранней фазы заживления (на 3 сутки) вследствие усиления ангиогенеза и пролиферации фибробластов в зоне регенерации. Анализ срезов образцов ткани, взятой в очаге язвообразования на 7 сутки после операции, показал четкие различия картин восстановительного процесса в подслизистом слое желудка у крыс опытной и контрольной групп.

 

В грануляционной ткани опытных животных преобладали четко ориентированные фибробласты, около которых выявлена рыхлая сеть межклеточного матрикса. Отмечали статистически достоверное (р < 0,05) по сравнению с контрольной группой снижение количества нейтрофилов (с 19,9 ± 1,7 % в контроле до 7,9 ± 0,5 % в опыте) и увеличение количества фибробластов (от 26,3 ± 1,4 % в контроле до 56,6 ± 1,8 % в опыте) (рис. 5а). Анализ ангиогенеза в подслизистом слое желудка на 7 сутки выявил, что в опытной группе животных количество зрелых сосудов было достоверно выше на 21,7 %, чем в контрольной группе (рис. 5б). Таким образом, на модели экспериментальной язвы желудка у крыс выявлено противовоспалительное и ранозаживляющее действие АРС. АРС, сдвигая фазу пролиферации на более ранние сроки, ускоряет заживление язвы желудка.

Заключение

Полученные данные свидетельствуют о том, что сериновая протеиназа гемостаза АРС регулирует активность тучных клеток, стабилизируя их и блокируя секрецию медиаторов воспаления в условиях in vitro и in vivo. АРС оказывает противовоспалительное и стабилизирующее действие не только на клетки эндотелия, как было показано ранее [6], но и на тучные клетки иммунной системы. Антиульцерогенное действие АРС, обнаруженное нами, объясняется антивоспалительными и пролиферативными свойствами протеиназы.

Работа поддержана грантом РФФИ (08-04-00886)

ЛИТЕРАТУРА

1. Макарова А.М., Русанова А.В., Горбачева Л.Р. и др. Влияние активированного протеина С на секреторную активность перитонеальных тучных клеток крысы // Бюлл. эксп. биол. мед. — 2006. — Т. 142, № 10. — С. 382–385. 2. Русанова А.В., Макарова А.М., Струкова С.М. и др. Пептид — агонист рецептора тромбина, иммобилизованный в микросферы, ускоряет репаративные процес- сы в модели язвы желудка у крыс. // Бюлл. эксп. биол. мед. — 2006. — Т. 142, № 7. — С. 42–46. 3. Dahlback B., Villoutreix B.O. Regulation of blood coagulation by the protein C anticoagulant pathway: novel insights into structure — function relationships and molecular recognition // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. — 2005. — Vol. 25, № 7. — Р. 1311–1320. 4. Dugina T.N., Kiseleva E.V., Glusa E., Strukova S.M. Activation of mast cells induced by agonists of proteinase–activated receptors under normal conditions and during acute inflammation in rats. // Eur. J. Pharmacol. — 2003. Vol. 471, № 2. — P. 141–147. 5. Esmon C.T. Coagulation inhibitors in inflammation // Biochem. Soc. Trans. — 2005. — Vol. 33, pt. 2. — P. 401–405. 6. Finigan J.H., Dudek S.M., Singleton P.A. et al. Activated protein C mediates novel lung endothelial barrier enhancement: role of sphingosine 1–phosphate receptor transactivation // J. Biol. Chem. — 2005. — Vol. 280, № 17. — P. 17286–17293. 7. Griffin J.H., Fernández J.A., Gale A.J., Mosnier L.O. Activated protein C // J. Thromb. Haemost. — 2007. — Vol. 5, suppl. 1. — Р. 73–80. 1. Макарова А.М., Русанова А.В., Горбачева Л.Р. и др. Влияние активированного протеина С на секреторную активность перитонеальных тучных клеток крысы // Бюлл. эксп. биол. мед. — 2006. — Т. 142, № 10. — С. 382–385. 2. Русанова А.В., Макарова А.М., Струкова С.М. и др. Пептид — агонист рецептора тромбина, иммобилизованный в микросферы, ускоряет репаративные процес- сы в модели язвы желудка у крыс. // Бюлл. эксп. биол. мед. — 2006. — Т. 142, № 7. — С. 42–46. 3. Dahlback B., Villoutreix B.O. Regulation of blood coagulation by the protein C anticoagulant pathway: novel insights into structure — function relationships and molecular recognition // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. — 2005. — Vol. 25, № 7. — Р. 1311–1320. 4. Dugina T.N., Kiseleva E.V., Glusa E., Strukova S.M. Activation of mast cells induced by agonists of proteinase–activated receptors under normal conditions and during acute inflammation in rats. // Eur. J. Pharmacol. — 2003. Vol. 471, № 2. — P. 141–147. 5. Esmon C.T. Coagulation inhibitors in inflammation // Biochem. Soc. Trans. — 2005. — Vol. 33, pt. 2. — P. 401–405. 6. Finigan J.H., Dudek S.M., Singleton P.A. et al. Activated protein C mediates novel lung endothelial barrier enhancement: role of sphingosine 1–phosphate receptor transactivation // J. Biol. Chem. — 2005. — Vol. 280, № 17. — P. 17286–17293. 7. Griffin J.H., Fernández J.A., Gale A.J., Mosnier L.O. Activated protein C // J. Thromb. Haemost. — 2007. — Vol. 5, suppl. 1. — Р. 73–80.

Peritoneal mast cells as target of activated protein C anti-inflammatory activity

A.V. Rusanova, T.V. Vasileva, M.D. Smirnov, S.M. Strukova

Lomonosov Moscow State University, Moscow

The functions of activated protein C (APC) as a modulator of inflammation are mediated by the proteinase- activated receptor 1 (PAR1) on endothelial cells, monocytes and other cells. Some of these effects may be induced by down-regulation with APC of mast cell activation. To characterize the influence of APC on rat peritoneal mast cells (PMC), degranulation of PMC in response to agonists, such as thrombin and substance 48/80, and the effects of APC on the agonist-induced secretion were investigated. The release of histamine from PMC activated spon- taneously or with substance 48/80 or thrombin (50-100 nM) was reduced by APC (0,1 and 1nM). APC -induced protective effect on activated PMC was mediated via proteinase-activated receptor 1 (PAR-1), as evidenced by antagonists of PAR-1 (SCH 79797 (0,2 μM) and Mpr(Cha) (0,1 μM)) which induced blockade of PAR-1. It was shown that prophylactic i.p. administration of APC stabilized the inflammatory PMC, which were obtained from rats subjected to immobilization stress, by blocking of mediators (histamine and β-hexosaminidase) release. The anti-inflammatory and wound-healing effects of APC in the model of experimental gastric ulcer in rats were found. APC accelerated the healing of gastric ulcers in rats, by shifting the proliferative phase to an earlier date this way. Thus it was shown that APC stabilizes the rats mast cells activated in vitro and in vivo and also has anti-ulcerogenic action. (Cytokines and Inflammation. 2009. Vol. 8, No 3. P. 48–53.)